Новости
Content
e-mail: kirov@sanepid.ru Сегодня: 18.04.2024
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Федеральное бюджетное учреждение здравоохранения “Центр гигиены и эпидемиологии в Кировской области”
Все виды санитарно-эпидемиологических экспертиз, лабораторных исследований.
Защита прав потребителей.
ПРЕЙСКУРАНТ ПРЕЙСКУРАНТ
РАЗРЕШИТЕЛЬНЫЕ ДОКУМЕНТЫРАЗРЕШИТЕЛЬНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
БЛАНКИ ЗАЯВОК НА УСЛУГИБЛАНКИ ЗАЯВЛЕНИЙ НА УСЛУГИ
БЛАНКИ ЗАЯВОК НА УСЛУГИБЛАНКИ ЗАЯВЛЕНИЙ НА ЛИЦЕНЗИРОВАНИЕ
ЛЕТНЯЯ ОЗДОРОВИТЕЛЬНАЯ КАМПАНИЯЛЕТНЯЯ ОЗДОРОВИТЕЛЬНАЯ КАМПАНИЯ


ОТЗЫВОТЗЫВ О РАБОТЕ ЦЕНТРА
ОТЗЫВОТЗЫВ О КАЧЕСТВЕ ОКАЗАНИЯ УСЛУГ ОРГАНОМ ИНСПЕКЦИИ
Новости
Специфическая лабораторная диагностика парентеральных вирусных гепатитов 14.08.2012

Специфическая лабораторная диагностика парентеральных вирусных гепатитов


Основой  постановки  диагноза «вирусный  гепатит»  служат знания о его возбудителе, его  репликации, информации о появлении и исчезновении маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот.

Серодиагностика вирусного гепатита В

Рисунок 1. Структура 
вируса гепатита В
Вирус гепатита В (HBV) относится к семейству Hepadnoviridae. Геном вируса представлен частично сдвоенной кольцевой молекулой ДНК размером 3200 п.н. При световой микроскопии HBV выглядит сферической частицей диаметром 42 нм (частица Дейна), состоящей из ядра - нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка входят HBcAg и HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном HBV – HBsAg (рис.1). Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, т. е. его ДНК может    частично встраиваться в геном гепатоцитов.
   
Основой лабораторной диагностики HBV инфекции является определение серологических маркеров инфицирования вирусом: HBsAg, HBeAg, анти-НВс класса IgM и IgG, анти-НВе и анти-HBs, HBV ДНК и активности вирусной ДНК - полимеразы. В зависимости от течения вирусного гепатита В спектр изменения серологических маркеров выглядит по-разному.

Рисунок 2. Спектр изменения
серологических маркеров
при вирусном гепатите В
Первым серологическим маркером вируса, обнаруживаемым в сыворотке крови, является HBsAg. Этот антиген  достигает доступных для детекции концентраций спустя 6 недель после внедрения вируса в организм человека и продолжает персистировать в крови человека от нескольких недель до нескольких месяцев. Длительное (свыше 6 месяцев после появления первых клинических симптомов заболевания) выявление HBsAg в сыворотке крови свидетельствует о формировании хронической инфекции. Поверхностный антиген вируса гепатита В является маркером как острой, так и хронической инфекции. В последнее время все большее внимание привлекает так называемая скрытая, или латентная, инфекция, вызванная вирусом гепатита В. Это феномен, при котором имеет место персистирование вируса, однако HBsAg в сыворотке крови пациентов не определяется. Следует подчеркнуть, что в настоящее время в лечебно-диагностических учреждениях и центрах сбора крови HBsAg остается основным маркером инфицирования вирусным гепатитом В. Поэтому определение ДНК вируса с целью установления латентной инфекции приобретает все большее значение. Причинами, по которым в сыворотке крови пациентов может выявляться ДНК вируса при отсутствии HBsAg, могут быть:
  • совпадение времени исследования с фазой «серологического окна», когда HBsAg уже не определяется, а концентрация анти-НВs еще не достигла необходимого уровня для выявления его коммерческими тест-системами;
  • формирование циркулирующих иммунных комплексов «HBsAg/ анти-НВs»;
  • супрессия синтеза HBsAg при ко-инфицировании вирусом гепатита С, ВИЧ и другими вирусами;
  • наличие «ускользающего» (мутантного) варианта вируса,  HBsAg которого не выявляется коммерческими тест-системами.
Наиболее чувствительным показателем вирусной репликации является выявление ДНК вируса гепатита В в крови. Исследование на наличие ДНК в сыворотке крови  имеет большое значение при обследовании контактных лиц с целью наиболее раннего выявления инфекции. ДНК вируса гепатита В обнаруживается при любых формах инфекции. Определение вирусной нагрузки (концентрация ДНК вируса гепатита В в крови) является важным параметром при определении показаний к лечению и контроля его эффективности.

HBeAg – вирусспецифический белок, является отдельным антигеном вируса. При острой инфекции, которая завершается выздоровлением, HBeAg появляется в сыворотке крови вслед за поверхностным белком вируса и перестает обнаруживаться до исчезновения HBsAg. При хронической инфекции HBeAg присутствует в крови длительные сроки, свыше 6 месяцев. Обнаружение HBeAg в сыворотке крови служит косвенным доказательством активной вирусной репликации.

HBсAg – сердцевинный антиген, обнаруживается только в ткани печени, поэтому практического значения этот маркер не имеет.

Большую диагностическую значимость имеют антитела к этому антигену (анти-НВс). Анти-НВс  начинают определяться в крови после появления первых клинических симптомов заболевания. Маркером ранней инфекции являются анти-НВс класса IgM. Определение их является одним из достоверных серологических критериев острого вирусного гепатита В.

Анти-HBc IgM выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. У 4-20 % больных острым гепатитом В анти-HBc IgM являются единственным маркером инфекции. При хроническом вирусном гепатите В анти-НВс IgM могут быть выявлены у некоторых больных в меньших титрах, чем при острой инфекции, причем титр антител отражает тяжесть гепатита.

Анти-HBc IgM постепенно замещаются анти-НВс класса IgG. Антитела этого класса удается обнаружить как у больных острым гепатитом В на различных стадиях инфекционного процесса, так и у больных хроническим вирусным гепатитом В, а также у лиц, перенесших в прошлом гепатит В и выздоровевших. Интерпретацию результатов в тестируемом образце проводят только с учетом выявления других маркеров инфекции.

Антитела к HBsAg (анти-НВs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета (защитный уровень - 10 МЕ/мл). Они появляются в период выздоровления, через 4 недели после исчезновения HBsAg, достигая максимальной концентрации через 1-2 года, с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. Анти-HВs  обычно персистируют длительно, возможно в течении всей жизни. Появление анти-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком. Важно отметить, что в динамике острой инфекции HBV имеется "окно", когда HBsAg уже не определяется, а анти-HBs еще не появились. При этом выявляются анти-HBc IgM и IgG. Из этого следует вывод о необходимости обследования больных ОВГ на анти-HBc IgM даже при отрицательных результатах исследования HBsAg и анти-НВs.

Антитела к HBeAg (анти-НВе) появляются в крови после элиминации HBeAg и завершения репликации вируса. К концу 9-й недели острого периода гепатита В более 90% больных имеют анти-НВе. В период выздоровления анти-НВе могут исчезать. Однако, наличие анти-НВе не является показателем отсутствия инфекционности конкретной сыворотки крови. Показано, что у ряда больных в ходе развития гепатита В (около 10%) под влиянием "иммунного давления" на вирус возникают мутантные формы, которые "избегают" иммунного надзора и не элиминируются. У носителей анти-HBe был выделен мутант, неспособный продуцировать HBeAg из-за дефектов в области precore и получивший обозначение HBeAg-отрицательного. Появление HBeAg-отрицательного мутанта приводит к прогрессированию поражения печени при продолжающейся репликации вируса (наличие ДНК HBV в сыворотке крови). При первичном инфицировании HBeAg-отрицательным мутантом существенно возрастает риск развития фульминантного гепатита.

Вирусный гепатит В имеет свой серологический профиль (табл.1). Характер появления и исчезновения маркеров инфицирования зависит от наличия  у больного «дикого» или «мутантного» вируса гепатита В. При инфицировании «диким» штаммом вируса после завершения острого гепатита В  сохраняется синтез HBsAg. Выявляются показатели репликации вируса: HBeAg и ДНК HBV).  Анти-НВс  циркулируют параллельно с  HBsAg. Титры IgM к HBeAg могут колебаться, однако они ниже, чем при остром гепатите В. Интегративная фаза хронического гепатита В характеризуется прекращением синтеза HBeAg и через фазу «окна» по HBeAg/ анти-НВе регистрируют анти-НВе. При заражении или появлении мутантного по pre-core зоне ДНК вируса гепатита В регистрируется иной серологический профиль. Точечная мутация вируса гепатита В вызывает прекращение синтеза HBeAg, что ведет к более активной атаке на гепатоциты. На протяжении всего течения  хронического гепатита, при наличии анти-НВе, чередуются подъемы и спады активности сывороточных трансаминаз. Параллельно происходит репликация ДНК вируса и выявление анти-НВс IgM. Установлено, что частота формирования цирроза печени у больных хроническим гепатитом В с серологическим профилем «анти-НВе+/ДНК HBV+» выше, чем у больных, инфицированных «диким» штаммом (HBeAg+/ ДНК HBV+) (Турьянов, 1999).

Таблица №1. Основные маркеры гепатита В при различных клинических формах.

Клиническая форма

HBsAg

HBeAg

Анти-HBc IgM

Анти-HBc сумм.

Анти-НВе

Анти-HВs

ДНК HBV

Острый гепатит В, «дикий» штамм

+

+

+

+

-

-

+

Острый гепатит В, «мутантный» штамм

+

-

+

+

-

-

+

Острый гепатит В разрешившийся; Сероконверсия

+

-

+/-

+

+

-

-/+

Хронический гепатит В активный

+

+

+/-

+

-/+

-

+

Хронический гепатит В интегративный

+/-

-/+

-/+

+

+/-

-

+/-

«Здоровое» носительство

+

-

-

+

-

-/+

-

Перенесенный вирусный гепатит В

-

-

-

+

-/+

+

-

Состояние после иммунизации

-

-

-

-

-

+

-


Для выявления антигенов и антител возбудителя используются тест-системы, основанные на принципах иммуноферментного анализа (ИФА) или хемилюминисцентного анализа (ХЛА). Недостатком данных методов является невозможность его использования при заражении мутантными формами вируса, при иммуносупрессии (больные онкологическими заболеваниями, наркоманы и т.д.) и для количественной оценки присутствующего в организме возбудителя. Решение этих задач стало возможным в результате внедрения молекулярно-биологических методов в практику клинико-диагностических лабораторий. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) существенно расширяет возможности лабораторной диагностики вирусного гепатита В, позволяя непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе - на фоне противовирусной терапии.

Серодиагностика вирусного гепатита С

Рисунок 3. Структура вируса гепатита С
Вирус гепатита С (HCV) является РНК содержащим гепатотропным и лимфотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae. Геном вируса   представлен одноцепочечной молекулой  РНК размером около 9500 оснований, кодирующей структурные и неструктурные белки
 
К  структурным белкам относят белок сердцевины и гликопротеины оболочки. Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью, в первую очередь РНК-зависимая - РНК полимераза. Помимо вирусных белков, снаружи вирион покрыт липидной оболочкой,  состоящей из липопротеинов организма хозяина (рис.3).

Лабораторная диагностика  была решена при помощи современных методов молекулярной биологии, учитывая, что при гепатите С вирус находится в крайне низкой концентрации и его антигены не доступны выявлению с помощью современных методов индикации, усилия исследователей сосредоточены на выявлении антител к различным антигенным компонентам вируса, обнаружение которых может служить индикатором наличия вируса.  В качестве антигенов использовали белки, кодированные структурной и неструктурной зоной РНК-ВГС, полученные при помощи рекомбинантной технологиии или синтеза (полипептиды, используемые в современных иммунологических методах – С22-3; С33с, С100-3, С200, NS5, S-1-1).

Лабораторная диагностика гепатита С основывается на обнаружении серологических маркерв НСV: антител к вирусу гепатита С (анти-HCV, анти-HCV класса IgМ, IgG) методом ИФА и РНК HCV методом ПЦР.  К настоящему времени разработаны 4 поколения тест-систем для выявления анти-HCV в иммуноферментном методе, но ИФА первого поколения сейчас не используется из-за низкой чувствительности.  РНК HCV является показателем активной репликации вируса гепатита С и самым ранним маркером инфекции, и может быть обнаружена методом ПЦР уже через 1- 2 недели после инфицирования, незадолго до повышения уровня сывороточных трансаминаз.  Анти-HCV обнаруживаются к 5-6 неделе после начала гепатита в 80% случаев и к 12 неделе у 90% лиц методом ИФА. При определении анти-HCV в некоторых случаях регистрируется ложноположительная реакция. Для разграничения ложноположительных образцов от образцов действительно содержащих антитела к вирусу, разработаны дополнительные тесты – рекомбинантный иммуноблотинг, определение спектра белков анти-HCV.

Спектр анти - HCV может различаться в зависимости от периода острого гепатита. Первым удается определить антитела, кодированные core и  NS5 зонами РНК вируса. Анти-HCV к белкам, кодированным NS4 зоной, в острую фазу гепатита С отсутствуют.

Выявление РНК HCV считается «золотым» стандартом в диагностике гепатита С и подтверждением положительных результатов обнаружения анти-HCV.  В настоящее время для индикации РНК HCV используется ПЦР в качественном и количественном варианте. Чувствительность методов определения РНК HCV повышается с каждым годом, достигая в настоящее время 10-50 копий РНК в 1 мл крови.  Диагноз хронического гепатита С у лиц с наличием анти-HCV обычно ставится на основании повышенных печеночных проб в течение более 6 месяцев.

Особенность вируса гепатита С – высокая изменчивость, не только в пределах различных стран, но и у одного и того же больного на протяжении заболевания. В мире наиболее распространены пять генотипов вируса гепатита С – 1а, 1в, 2а, 2в, 3а. Определение принадлежности вируса гепатита С к тому или иному генотипу (субтипу) необходимо для решения не только научных, но и практических вопросов. В настоящее время в большинстве случаев для генотипирования РНК вируса применяются методы, основанные на проведении ПЦР с использованием типоспецифических праймеров.

Серодиагностика вирусного гепатита D
Вирус гепатита D (HDV) – сферическая частица размерами от 28 до 39 нм, по своей организации и морфологической структуре подобная вирусу гепатита В, но с менее четко отграниченным ядром. Нуклеиновая кислота вируса – однонитевая циклическая молекула РНК, негативной полярности, протяженностью около 1700 неклеотидов. Дельта-агент считают вирусом, но не относят ни к одному из известных семейств. В настоящее время его рассматривают как единственного представителя нового рода Deltavirus.

 Лабораторная диагностика осуществляется путем обнаружения серологических маркеров HDV, включая наличие антигена, антител к нему и РНК HDV.   Обнаружение антигена HDV и РНК HDVв сыворотке крови или ткани печени свидетельствует о наличии активной HDV-инфекции, однако, следует отметить, что эти маркеры могут не обнаруживаться в сыворотке больных фульминантным  гепатитом D. Маркером активной репликации HDV также является анти-HDV класса IgМ. Серологические маркеры инфекции  зависят от того, как был приобретен вирус – в виде коинфекции с HBV (у большинства больных заболевание имеет острое течение и заканчивается выздоровлением) или суперинфекции у больных с хронической HBV-инфекцией (протекает тяжелее, чем коинфекция - в 10% развивается фульминантный гепатит). При коинфекции в большинстве случаев антитела - анти-HDV класса IgМ и IgG - обнаруживаются в течение заболевания.  Титр анти-HDV обычно снижается до практически неопределяемых уровней после выздоровления, и не сохраняется никаких серологических маркеров того, что человек был когда-либо инфицирован HDV.  Антиген HDV определяется только у 25% больных и обычно исчезает вместе с исчезновением HВsAg. При суперинфекции у больных с хронической HBV-инфекцией серологическая картина имеет следующие характерные особенности: – титр HBsAg снижается к моменту появления антигена HDV в сыворотке; - антиген HDV и РНК-HDV продолжают определяться в сыворотке, так как обычно у большинства пациентов с суперинфекцией гепатита D(70-80%) развивается хроническая инфекция, в отличие от случаев коинфекции; - определяются высокие титры антител (анти-HDV) как класса IgМ, так и IgG, которые сохраняются неопределенное время. Серологические маркеры вируса гепатита D определяют методом иммуноферментного и радиоиммунного анализа, а РНК-HDV - методом полимеразной цепной реакции.

Перед лабораторным работником стоит четкая задача – предоставить объективную информацию о выявленном спектре вирусных антигенов и антител, а также нуклеиновых кислот вирусов, отвечающих за развитие гепатита.

Однако, при постановке диагноза «вирусный гепатит» необходимо учитывать не только наличие или отсутствие маркеров инфицирования вирусом, но и показатели активности «печеночных» ферментов, данные эпидемиологического анамнеза, результаты клинического осмотра пациента. Только комплексный учет перечисленных факторов позволяет с высокой степенью надежности диагностировать это заболевание.


Для лабораторной диагностики вирусных гепатитов необходимо произвести забор крови из вены. Для исключения ложноположительных результатов кровь на маркеры лучше исследовать в специализированной лаборатории. Рекомендуем обратиться к нам, в Аккредитованный Испытательный лабораторный центр ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Кировской области». Мы используем передовые методы диагностики, делающие процесс более простым и быстрым. Поэтому наши цены доступны для всех категорий населения. Не волнуйтесь! Все процедуры производятся специалистами с помощью современных одноразовых стерильных инструментов. Делать анализ крови в нашей лаборатории не больно и    совершенно безопасно!

Мы ждем Вас по адресу: 610000, г. Киров, ул. Свободы, 64А, корпус №3; http://www.sanepid.ru; e-mail:dez@sanepid.ru; телефон: (8332) 38-19-16, 38-20-98.



Возврат к списку новостей